국내에서 시판되고 있는 크로와상 냉동생지의 미생물학적 품질 및 위생 상태 평가

소비자가 흔히 크로와상 냉동생지를 구매할 수 있는 경로인 마트 또는 인터넷 쇼핑몰을 통해 시료를 구입하였다. 각 구입경로에서 서로 다른 3가지의 냉동생지를 5개씩 구입하였으며(총 30개), 모든 시료는 실험하기 직전까지 본래의 보관 방법에 따라 냉동고에서 보관하였다.

일반세균의 오염도를 확인하고 검출된 세균의 종류를 파악하기 위하여 평판도말을 실시하였다. 평판도말을 위한 배지는 Plate Count Agar (PCA; Becton, Dickinson, and Company, USA)를 사용하였다. 시료의 균질화 및 십진희석을 위하여 0.85% 멸균생리식염수를 사용하였다.

냉동 상태로 보관되어 있던 냉동생지는 실험하기 전 미리 상온에서 최대 30분 동안 해동하였다. 냉동생지 포장지 표면을 70% 에탄올로 소독한 후 클린벤치 내부로 옮겼다. 화염멸균한 가위를 이용하여 무균적으로 포장을 개봉하고, 화염멸균한 칼과 집게를 이용하여 시료 25±1 g을 취한 뒤 멸균필터백(3M™, USA)에 옮겨 담았다. 시료가 담긴 멸균필터백에 0.85% 멸균생리식염수 225 mL를 첨가하고 pummeler (BagMixer^® 400, Interscience, France)로 2분간 균질화 시켰다. 균질액 1 mL을 0.85% 멸균생리식염수로 적절히 십진희석한 뒤 PCA에 0.1 mL 또는 1 mL을 분주 및 도말 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 집락을 계수하여 일반세균의 오염도(CFU/g)를 분석하였다. 일반세균 오염도의 시료 간 유의적 차이 분석을 위하여 One-way ANOVA를 수행하였으며 이 때 SAS^® version 9.4 (SAS^® Institute, USA)를 사용하였다.

또한, 일반세균 집락의 색, 모양, 크기, 집락 표면의 형태 등과 같은 표현학적 특성에 따라 육안으로 집락을 구분하였다. 집락 구분 후 멸균 loop를 이용하여 집락을 취한 뒤 PCA에 반복적으로 분리배양하여 단일 집락을 획득할 수 있도록 하였다.

표현학적 특성에 따라 육안으로 구분된 세균을 species 수준으로 명확히 확인하기 위하여 ㈜코스모진텍에 의뢰하여 16s rRNA sequencing 분석을 실시하였다. 세균 동정을 위한 프라이머로 27F와 1492R을 사용하여 PCR 및 시퀀싱을 진행하였다. 시퀀싱 결과를 활용하여 서열 간 유사성 및 차이를 확인하고, align과 BLAST를 통해 최종적으로 세균을 동정하였다.

산업체에서의 식품 위생 확보 방안은 다양한데, 그 중 Hazard Analysis Critical Control Point (HACCP)의 적용이 널리 알려져 있다. HACCP은 위해요소분석(Hazard Analysis)과 중요관리점(Critical Control Point)의 영문 약자로서 위해 방지를 위한 사전 예방적 식품안전관리체계를 말한다(한국식품안전관리인증원, 2024). 빵류의 경우 HACCP 의무적용 유형으로 분류되며, 본 연구에 사용된 크로와상 냉동생지 6가지의 시료 중 5개는 제품 표면에 HACCP 인증마크가 표기되어 있어 HACCP 적용을 받은 제품임을 알 수 있었다. 1개의 경우 인증마크는 없으나 유선상 확인한 결과 HACCP 인증을 받은 제품임을 확인하였다.

냉동생지에서의 일반세균 오염도는 평균 132.6±152.8 CFU/g이었으며, 최소 20 CFU/g, 최대 620 CFU/g으로 오염되어 있음을 확인하였다(Table 1). One-way ANOVA 분석에 따르면 일반세균의 오염도는 시료의 종류에 따라 유의적인 차이(p=0.001)가 있음이 확인되었다.

PCA에 확인된 집락을 16s rRNA sequencing으로 동정하기 위하여 형태학적 특징에 따라 구분 및 분리배양하였다. 그 결과, 총 4개의 속(Bacillus spp., Staphylococcus spp., Aneurinibacillus spp. 및 Enterococcus spp.)에서 23개의 세균이 확인되었다(Fig. 1 및 Table 2). Bacillus spp.가 17개(73.9%)로 가장 높은 비율로 관찰되었고, Staphylococcus spp.(3개, 13.0%), Aneurinibacillus spp.(2개, 8.7%), Enterococcus spp.(1개, 4.3%) 순으로 나타났다.

Fig. 1. The profile of total aerobic bacteria at species level in frozen croissant dough.

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Bacillus spp.에서는 Bacillus pumilus가 4개로 가장 많았고, Bacillus cereus 3개, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, Bacillus sonorensis가 각 2개씩, Bacillus safensis와 Bacllus wiedmannii가 각각 1개씩 관찰되었다. 가장 빈번하게 관찰된 B. pumilus는 성층권 공기, 토양, 심해 퇴적물 및 일부 극한 환경에 서식하는 균으로 환경 스트레스에 대하여 높은 적응성과 저항성을 가지고 있다. 독소 생성의 능력을 가지고 있어 식중독을 유발하거나 피부감염을 일으킬 수 있다(Wang et al., 2022). B. cereus의 경우 식중독 세균으로 익히 알려져 있는데, 설사 또는 구토를 유발시키는 독소를 생성하여 식중독을 유발한다. 설사를 유발하는 독소는 enterotoxin이며, 설사형 식중독은 육류, 채소 스프, 크림, 소시지 등이 원인식품이 된다. 구토를 유발하는 독소는 emetic toxin이며 쌀밥이나 볶음밥이 원인식품이다(Park et al., 2020). 그 외 B. licheniformis, B. amyloliqeufaciens, B. velezensis, B. sonorensis, B. safensis는 병원체로 인식되기 보다는 항균 활성을 가지고 있거나 식품 산업에서 활용 가능한 균주로서의 활용 가치를 인정받고 있다. 예를 들어, B. licheniformis는 자연에 흔히 존재하며 내인성 독소가 없어서 식품 안전 균주로 인증되었다(Muras et al., 2021). 메주에 널리 분포하며 염에 강하다고 알려져 있는데(Jeong et al., 2014; Nam et al., 2012), 이러한 특성으로 인하여 고염 대두 발효에 적합한 스타터로 사용할 수 있다(Jeong et al., 2017). B. amyloliquefaciens는 항균활성이 뛰어난 균으로 알려져 있으며 Benitez 등의 연구결과에 따르면 B. amyloliquefaciens LBM5006 균주는 Aspergillus niger, Fusarium graminearum, Cercosporina sojina의 생육을 저해한다고 알려져 있다 (Benitez et al., 2010). 인간 병원체로 알려져 있지 않지만, 최근 몇 년간 면역이 저하된 환자에게서 기회 감염 병원체로서의 인식이 높아지고 있다(Baptiste et al., 2017). B. sonorensis의 한 종류인 B. sonorensis MT93은 박테리오신 생산 능력을 가지고 있는데, 이는 과일 제품에서 Staphylococcus aureus 및 Listeria monocytogenes에 대한 방부제 및 저온살균 우유의 유통기한 연장제로서 사용되었다(Chopra et al., 2015). 또한, B. sonorensis가 생산한 exopolysaccharides(EPS)는 프리바이오틱스로 사용될 수 있다(Palaniyandi et al., 2018). Hascoët 등에 따르면 B. safensis는 여러 L. monocytogenes에 부착하여 생물막 형성을 억제하였고, 지질펩타이드 구조를 가진 생물계면활성제 물질을 생산하여 여러 병원체에 대해 항균 특성을 가지고 있는 것으로 알려졌다(Hascoët et al., 2021). 항병원성 메커니즘은 곰팡이에도 적용되며(Mayer et al., 2017), 필수 아미노산, 비타민 생성에 도움을 주는 프로바이오틱스로 활용할 수 있음이 밝혀졌다(Saidumohamed and Bhat, 2021).

3개의 Staphylococcus spp.는 각각 Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus warneri로 확인되었다. S. gallinarum는 가금류에서 많이 발견되는 균주로 감염될 경우 약하지만 식중독 증상을 유발할 수 있는 병원성 세균이다(Morfin-Otero et al., 2012). S. sciuri는 낙농 산업에서 널리 발견되는 세균인데(Naik et al., 2018), 주로 동물에게 질병을 유발하며 인간에게도 정착할 수 있고 피부, 질, 혈액, 소변 등 임상 샘플에서 분리된 것으로 보고되었다. 농양, 종기, 복막염 및 심내막염을 유발할 수 있다(Stepanović et al., 2001). S. warneri는 사람과 쥐의 장내 미생물의 본래 존재하는 상재균이며, 보통 비병원성으로 간주된다(Kamath et al., 1992).

Aneurinibacillus spp.는 2개 모두 Aneurinibacillus aneurinilyticus로 확인되었다. A. aneurinilyticus는 농생태학적으로 유익한 균으로 알려져 있으며 식품에서는 농약 잔류물을 제거하는 수단이나(Yu et al., 2024), L. monocytogenes나 Campylobacter jejuni에 대하여 살균 효과가 입증되어 가금류의 방제를 위한 사료 첨가제로 유용할 수 있다(Rubinelli et al., 2023).

1개만이 관찰된 Enterococcus spp.는 Enterococcus mundtii로 밝혀졌으며, Wister 쥐를 대상으로 한 임상 시험에서 E. mundtii ST4SA는 병원성이 없는 것으로 나타났고, 병원체에 대해 활성을 갖는 항균 펩타이드를 생산하며 프로바이오틱스로 간주될 수 있다(Ramiah et al., 2009). 발효 유제품인 Dahi에서 분리된 E .mundtii QAUEM2808 균주는 안전하며 우유 발효의 보조 배양물로서 제품의 품질을 향상시킬 가능성이 있음을 시사하였다(Nawaz et al., 2019). 사람에게 감염되는 것은 흔하지 않지만 이란에서 요로 감염된 환자로부터 E. mundtii를 포함한 Enterococcus를 분리하였다(Sharifi-Rad et al., 2016).