Chicken Serum과 Horse Serum이 닭 근육위성세포의 증식과 분화에 미치는 영향

직접 도축한 닭의 가슴살과 다리살의 근육조직으로부터 근육세포를 분리하여 사용하였다. 닭을 도축하는 과정은 충북대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다(IACUC No. CBNUA-1477-20-02).

다양한 혈청에 따른 닭가슴 근육세포와 닭다리 근육세포의 증식 능력을 비교하기 위하여 혈청을 넣지 않은 배지인 Negative Control(NC), 20% FBS를 첨가한 Control(C), 10% Chicken Serum(CS; 16110082, Gibco, New Zealand)과 5% Horse Serum(HS; 26050088, Gibco, New Zealand)을 첨가한 배지(T1), 10% CS을 첨가한 배지(T2), 5% HS을 첨가한 배지(T3)를 준비하여 세포를 배양하였다(Table 1).

세포를 증식하기 위해 콜라겐으로 코팅한 플라스크를 준비했다. 콜라겐 코팅 용액(C2124, Sigma- Aldrich)은 5 mg/mL의 콜라겐 용액을 증류수로 0.5% 농도로 희석하여 사용하였으며 콜라겐 가용화를 위해 최종 농도가 2%가 되도록 1 M 아세트산을 첨가하였다. 제조된 콜라겐 용액을 플라스크에 분주한 뒤, 37°C의 인큐베이터에서 16시간 방치하였다. 실험에 사용하기 전에 코팅 용액을 제거한 후, 플라스크를 1 × phosphate buffered saline(PBS; Cytiva HyClone^TM, UT, USA)를 사용하여 2회 세척하여 실험에 사용하였다. 세포 증식을 위한 배지(Growth Medium; GM)는 DMEM 배지(11995-065, Gibco, USA)에 1% penicillin-streptomycin-amphotericin B(PSA; 17-745E, Lonza, USA)와 실험 설계에 맞게 다양한 혈청을 첨가하여 제조하였다(Table 1). 효과적인 세포 증식 및 성장을 위해 basic fibroblast growth factor(bFGF; Gibco, USA)를 최종 농도가 0.05% 되도록 플라스크에 첨가한다. 닭가슴 근육세포와 닭다리 근육세포는 1,800 cells/cm²의 밀도로 플라스크에 분주하였으며, 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 6일간 배양하였다.

닭가슴 근육세포와 닭다리 근육세포의 계대배양에 따른 증식 능력을 비교하기 위해 이전의 세포 증식 실험에서 가장 성적이 좋았던 배지를 선정하여 두 세포를 배양하였다. 계대배양을 위해 플라스크 내 증식 배지를 제거한 후 트립신(25300062, Gibco, Canada)을 첨가하였다. 37°C 인큐베이터에서 3분간 방치하여 플라스크에서 세포를 떼어낸 후, PBS에 FBS를 2% 첨가하여 제조한 trypsin neutralizing solution(TNS)을 첨가하여 중화하였다. 350 × g의 속도로 5분간 원심분리하여 세포만 채취하였다.

세포를 분화시키기 위해 마트리겔(354234, Corning, VA, USA)로 코팅한 플라스크를 준비했다. 마트리겔을 차가운 1 × PBS와 1:200 비율로 희석하여 마트리겔 코팅 용액을 제조하였다. 제조된 마트리겔 코팅 용액을 플라스크에 분주한 뒤, 37°C의 인큐베이터에서 4시간 방치하였다. 실험에 사용하기 전에 코팅 용액을 제거한 후, 플라스크를 1 × PBS를 사용하여 2회 세척하여 실험에 사용하였다. 닭 근육세포는 1,800 cells/cm²의 밀도로 플라스크에 분주하였으며, 앞서 서술한 증식에 사용된 배지를 이용해 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 6일간 배양하였다. 분화에 사용된 배지(differentiation medium; DM)는 DMEM에 2% FBS와 1% PSA를 첨가하여 제조하였다. 6일간 증식시킨 닭가슴 근육세포와 닭다리 근육세포에서 증식 배지를 제거한 후 분화 배지를 첨가하여 분화를 유도하였다.

세포를 트립신을 이용해 플라스크에서 때어내고 TNS를 이용해 중화하였다. 트리판 블루 용액(T8154, Sigma, UK)으로 염색한 후 cell counter(Countess^® cell FL automated cell counter, Invitrogen, MA, USA)를 사용하여 세포 수를 계수하였다.

닭 근육세포를 96-well 플레이트에 1,800 cells/cm²의 밀도로 분주하고 37°C, 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 4일간 배양하였다. 배양액을 제거한 후 세포를 1 × BPS로 세척하고 2% 파라포름알데히드(GeneAll, Korea)로 37°C 인큐베이터에서 45분간 처리하였다. 1 × PBS로 세척한 후, 세포를 실온에서 0.1% Triton-X(Sigma-Aldrich, MO, USA)로 20분간 처리하였다. 그 후, 세포를 2% 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA; Roche, IN, USA)과 함께 실온에서 30분간 방치하고, 1 × PBS로 2회 세척하였다. 이후 Paired box 7(PAX7) 항체(1:100, PA5-68506, Invitrogen)와 함께 4°C에서 밤새 반응시켰다. 1 × PBS로 2회 세척한 후, 세포를 goat anti-rabbit IgG cross-adsorbed 2차 항체(1:1000, A21121, Invitrogen)와 함께 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 Hoechst(H3570, Invitrogen)으로 2분간 반응시켰다. 닭 근육 세포의 면역형광 염색은 EVOS-5000 광학현미경을 통해 관찰하였다.

닭가슴 근육세포(Fig. 1)와 닭다리 근육세포(Fig. 2)를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 다양한 혈청을 첨가한 배지로 6일간 배양하였다. 이후 Cell counter를 이용하여 살아있는 세포 수를 측정하였다 (Fig. 3). 10% tryptose phosphate broth 대신 닭 혈청을 첨가한 배지로 QM7 메추리 근육세포를 배양하였을 때, 근육 세포가 더 빠르게 성장하고 분열하였다는 연구 결과가 있으며(Choi et al., 2022), 말 혈청을 첨가한 배지가 병아리 배아세포의 증식을 크게 촉진하였다는 연구 결과도 있다(Verger, 1979). 닭가슴 근육 세포와 닭다리 근육 세포 모두 10% CS와 5% HS를 배지에 첨가한 실험구에서 가장 많은 세포를 측정할 수 있었다.

Fig. 1. Proliferation of cultured chicken breast cells from day 1 to day 6 (40 × magnification). (A) Control (Medium with FBS 20%), (B) Negative control (NC; medium without serum), (C) T1 (Medium with chicken serum 10%, horse serum 5%), (D) T2 (Medium with chicken serum 10%), (E) T3 (Medium with horse serum 5%).

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Fig. 2. Proliferation of cultured chicken leg cells from day 1 to day 6 (40 × magnification). (A) Control (Medium with FBS 20%), (B) Negative control (NC; medium without serum), (C) T1 (Medium with chicken serum 10%, horse serum 5%), (D) T2 (Medium with chicken serum 10%), (E) T3 (Medium with horse serum 5%).

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Fig. 3. Cell counting of chicken breast (CB) muscle cells and chicken leg (CL) muscle cells cultured for 6 days. C (Control; Medium with FBS 20%), NC (Negative control; Medium without serum), T1 (Medium with chicken serum 10%, horse serum 5%), T2 (Medium with chicken serum 10%), T3 (Medium with horse serum 5%).

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배양된 닭가슴 근육세포와 닭다리 근육세포를 Pax7 항체와 Hoechst를 사용하여 면역형광 염색을 하였다(Fig. 4). Pax7은 위성세포 유래 근아세포에서 특이적으로 발현되는 유전자로, 근육의 위성세포에서도 발현된다(Leale et al., 2000). Hoechst 염료는 세포의 DNA를 염색하여 핵을 확인하는데 사용되는 가장 인기 있는 형광체이다(Bucevičius et al., 2018). Hoechst 염색을 통해 세포의 DNA를 염색해 핵을 관찰하였고, Pax7 염색을 통해 근육 위성세포임을 확인하였다.

Fig. 4. Representative immunofluorescence microscopy image of the nuclei and pax7 of satellite cell from chicken breast muscle cells and chicken leg muscle cells after confluent of proliferation on day 6 (100 × magnification).

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닭가슴 근육세포와 닭다리 근육세포를 Passage 1부터 Passage 6까지 계대배양하면서(Fig. 5) 세포의 생존율과 살아있는 세포의 수를 측정하였다(Fig. 6). 앞선 실험에서 증식 능력 성적이 좋았던 10% CS와 5% HS를 첨가한 배지를 선정하여 계대배양에 따른 증식 능력을 확인하기 위한 배지로 사용하었다. 실험 결과, 계대배양을 진행할수록 세포의 생존율과 살아있는 세포의 수가 지속적으로 감소되는 것을 확인하였다. 모든 passage에서 닭다리 근육세포의 생존율과 살아있는 세포의 수가 닭가슴 근육세포보다 높게 나타났다.

Fig. 5. Proliferation of cultured chicken breast muscle cells and chicken leg breast muscle cells from day 1 to day 6 (40 × magnification). (A), (B), (C) Microscopy images showing the proliferation of chicken breast muscle cells from day 1 to day 6 from passage 1, 3, 5. (D), (E), (F) Microscopy images showing the proliferation of chicken leg muscle cells from day 1 to day 6 from passage 1, 3, 5.

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Fig. 6. Viability and cell counting of chicken muscle cells from passage 1 to passage 6. (A) Graph of viability of chicken breast muscle cells and chicken leg muscle cells from passage 1 to passage 6. (B) Number of live cells of chicken breast muscle cells and chicken leg muscle cells from passage 1 to passage 6.

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닭가슴 근육세포와 닭다리 근육세포를 분화 배지를 이용하여 6일동안 분화하였다(Fig. 7). 계대배양을 진행할수록 세포의 분화능력이 떨어져 분화가 이루어지지 않는 것을 확인하였지만, 닭다리 근육세포가 닭가슴 근육세포보다 분화 능력이 더 오래 유지가 된 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 7. Differentiation of cultured chicken breast muscle cells and chicken leg muscle cells from day 1 to day 6 (40 × magnification). (A), (B), (C) Microscopy images showing the differentiation of chicken breast muscle cells from day 1 to day 6 from passage 1, 3, 5. (D), (E), (F) Microscopy images showing the differentiation of chicken leg muscle cells from day 1 to day 6 from passage 1, 3, 5.

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