국내 수유부로부터 수집한 모유의 항산화 및 항용혈 효과

본 연구는 연구윤리심의위원회(institutional review board, IRB)의 승인을 받아 진행되었다(KGU-20191018-HR-046-04). 모유시료는 2020년 2월부터 2021년 2월에 수집되었으며, 모유 수집 대상자는 재태주수 36-40주 사이에 출산한 산후 6개월 이내의 만 20-40세 여성으로 고위험군 임산부에 해당된 이력이 없는 건강한 수유부를 대상자로 선정하였다. 모유는 1일 1회, 50 mL 이상 착유하여 멸균된 tube에 수집하였고, 수집한 모유는 분만형태, 출산경과일, 산모의 연령 및 재태주수로 분류하였다(Table 1). 수집한 모유는 -70℃에서 냉동보관 후, 연구 시 1 mL씩 무균적으로 소분하여 사용하였으며, 연구 종료 후 남은 모유시료는 폐기하였다.

모유의 pH 측정은 pH meter(ORION STAR A211, Thermo SCIENTIFIC, Indonesia)를 이용하여 측정하였고, 모유의 건조중량은 Kim 등(2007)의 방법을 참고하여 모유 시료를 각각 1 mL씩 취해 105℃에서 가열하여 수분을 증발시킨 후, 건조중량을 측정하여 고형분 함량(%)으로 나타내었다.

모유의 DPPH radical 소거능은 Blois(1958)의 방법을 참고하여 측정하였다. 대조군으로 0.1%(w/v) vitamin C를 사용하였으며, ethanol에 용해시킨 0.2 mM DPPH solution 500 μL에 모유시료 100 μL를 혼합하여 30분간 암반응 후, UV/VIS-spectrophotometer(BioTek, Vermont, USA)를 이용하여 520 nm에서 O.D.를 측정하였다. 소거능 값은 시료 첨가군(A)과 시료를 첨가하지 않은 blank군(A₀)간의 흡광도 비(%)로 나타내었다.

모유의 용혈성을 확인하기 위해 blood agar base(Kisan Bio Co., Seoul, Korea)에 5% defibrinated sheep blood(Kisan Bio Co., Seoul, Korea)를 첨가한 blood agar plate에 모유시료와 대조군으로 hemolysin을 생성하는 박테리아 S. aureus CCARM 3855, P. aeruginosa CCARM 0223을 획선도말하여 37℃에서 48시간 반응시킨 후, Argyri 등(2013)의 방법에 따라 용혈성을 확인하였다.

모유의 항용혈 효능은 Bezerra 등(2020)의 방법을 참고하여 측정하였다. 모유시료는 각각 0℃에서 5분간 원심분리(20,000 × g) 하여 0.45 µm filter(SM13P045SL, Hyundai micro Co., Seoul, Korea)로 여과하여 실험에 사용하였으며, hemolysin을 생성하는 박테리아 S. aureus CCARM 3855와 P. aeruginosa CCARM 0223은 각각 Tryptone Soy Broth(TSB, Difco)에 2%(v/v) 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후, 5분간 원심분리(20,000 × g)하여 0.2 µm filter(Hyundai micro Co.)로 여과하여 hemolysin을 포함하는 배양액을 실험에 사용하였다. 항용혈 효능을 측정하기 위해, 0.1 M Phosphate Buffered Saline(PBS, pH 7.0) 775 μL에 defibrinated sheep blood(Kisan Bio Co.) 25 μL와 hemolysin을 포함하는 배양액과 모유시료를 각각 100 μL 씩 첨가하여 혼합 후, 37℃에서 24시간 반응시켰다. 이후 5분간 원심분리(20,000 × g) 하여 상등액을 취해 UV/VIS-spectrophotometer(BioTek)를 이용하여 543 nm에서 흡광도를 측정하여 아래와 같이 모유시료 첨가군(A₀), 음성대조군(blank, A), 양성대조군(B) 간의 흡광도 비(%)를 계산하여 항용혈 효능을 비교하였다.

본 연구에서는 모든 실험을 3회 이상 반복 수행하였으며, 결과는 SPSS(Statistical Package for the Social Science, Ver. 20, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 통계분석하였다. 각 실험군에 대한 분석은 분산분석(ANOVA)을 실시하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검토하였고, 시료들의 특성에 대한 유의적인 차이는 Duncan’s multiple range test로 검증하였다.

본 연구에서는 인체 유래물 제공 대상자가 직접 작성한 설문지를 바탕으로 분만형태, 수집연도, 대상자의 연령, 출산경과일, 재태주수 등 모유시료의 일반적인 특성을 확인하였다(Table 2). 수집된 모유시료는 총 29개로 자연분만 및 제왕절개한 모체로부터 수집된 모유시료는 각각 11개(37.93%), 18개(62.07%)였다. 2020년도에 수집된 모유시료의 경우 자연분만은 5개(45.45%), 제왕절개는 6개(54.55%)였으며, 2021년도에 수집된 모유시료는 자연분만 11개(61.11%), 제왕절개 7개(38.89%)였다.

대상자의 연령 분포에 따라 분류한 결과, 25-30세에 해당되는 모유시료가 11개(37.93%)로 가장 많았고, 다음으로는 30-35세가 10개(34.48%), 35-40세가 5개(17.24%), 20-25세가 3개(10.34%) 순이었다.

출산경과일에 따라 분류하였을 때, 10일에서 30일 미만인 모유시료가 16개(55.17%)로 가장 많았고, 10일 미만은 7개(24.15%), 30일 이상에 해당되는 모유시료는 6개(20.69%)였다. 재태주수는 총 29개 모유시료 중 임신기간이 34주에서 36주인 후기조산(late preterm)에 해당하는 모유시료 1개를 제외하고 모두 37주 이상 완전주에 해당되었다.

모유가 산성화(acidification)될 경우 모유 내 세포 및 영양성분의 변화를 발생시킬 수 있으며, Erickson 등(2012)의 연구에 의하면, 산성화된 모유에서 백혈구 및 총 단백질 함량이 감소됨을 보고한 바 있어 모유의 산성화 정도는 모유의 신선도를 판단하는데 중요한 지표가 된다. 따라서 본 연구에서 수집한 모유의 신선도를 판단하기 위하여 분만형태, 대상자의 연령, 출산경과일, 재태주수에 따른 모유의 pH 및 건조중량의 차이를 분석하였다(Table 3).

분만형태별 자연분만과 제왕절개 모유시료의 pH를 측정한 결과, 자연분만 모유 시료는 pH 6.64±0.38, 제왕절개 모유 시료는 pH 6.48±0.19로 제왕절개에 해당되는 모유 시료의 pH가 낮았으나 두 그룹간 pH의 유의한 차이는 없었다(p>0.05).

대상자의 연령이 35-40세에 해당되는 모유 시료의 pH는 6.44±0.25로 다른 연령대에 해당되는 모유 시료보다 낮았으나 연령 간 모유의 pH에 대한 유의한 차이는 없었다(p>0.05).

또한 출산경과일이 10일 미만에 해당되는 모유 시료의 pH는 6.63±0.26, 10일 이상 30일 미만의 모유 시료는 6.53±0.33, 30일 이상의 모유 시료는 6.45±0.15로 나타나, 출산경과일이 오래될수록 모유의 pH가 낮아졌으나 각 그룹간 pH의 유의한 차이는 없었다(p>0.05).

재태주수가 37주 미만의 모유 시료의 pH는 6.50, 완전주에 해당되는 모유 시료의 pH는 6.54±0.29로 나타나 37주 미만의 모유 시료의 pH가 낮았으나 각 그룹간 pH의 유의적 차이는 없었다(p>0.05).

일반적으로 모유의 pH는 6.8-7.3으로 알려져 있다(Kim, 2010a). Erickson 등(2013)의 연구에서 측정한 모유의 pH 또한 6.8±0.1로 보고되었으나 본 연구에서 수집된 모유의 pH는 다소 낮게 측정되었다. 이러한 결과는 Hung 등(2018)이 보고한 바와 같이, 냉동과정에 의해 우유 지질의 결정화로 인한 지방구 막(fat globule membrane)이 손상되어 우유의 지방분해가 일어나 유리지방산 함량이 높아짐에 의한 것으로 추측해볼 수 있다. 또한 Hung 등(2018)의 연구에서 모유의 acid value는 보관기간이 길어질수록 높아지고, 유리지방산의 함량 또한 증가함을 보고하였으며, Floris 등(2020)은 수유기간이 길어짐에 따라 모유 내 지방산 함량이 증가함을 보고한 바 있어 본 연구에서 수집한 모유의 pH 변화는 모유 내 지방산에 의한 것으로 추정할 수 있다.

수집된 모유의 건조중량 측정결과, 자연분만 모유의 경우 11.27±0.78%, 제왕절개 모유의 경우 11.33±0.80%로 제왕절개 모유에서 더 높게 나타났으나 두 그룹간 건조중량의 유의한 차이는 없었다(p>0.05). 대상자의 연령별로는 25-30세에 해당되는 모유시료의 건조중량이 11.58±0.73%로 가장 높았으며, 35-40세가 11.19±0.86%, 20-25세가 11.12±0.32%, 30-35세가 11.11±0.90% 순으로 나타났으나 대상자의 연령별 건조중량의 유의한 차이는 없었다(p>0.05). 출산경과일로 분류한 결과, 10일 미만인 모유시료가 11.72±0.69%로 가장 높았으며, 다음으로 60일 이상 100일 미만이 11.52±1.48%, 100일 이상이 11.29±0.72%, 10일 이상 60일 미만이 11.09±0.67% 순으로 나타났으나 출산경과일 별 건조중량의 유의한 차이는 없었다(p>0.05). Lee(1988)의 연구에 의하면 모유의 총 고형분 함량이 12%인 것으로 보고하였는데, 이는 본 연구결과와 유사하였다.

활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 과도한 생성은 뇌실 주위 백혈병, 심실내 출혈, 기관지폐 이상형증, 미숙아 망막병증, 괴사성 장염 등과 같은 신생아 질환과 관련이 있으며, 감염 및 염증반응과 관련된 대식세포 및 호중구 활성화에 의해 방출된다(Trindade and Rugolo, 2007). 출생 후 신생아가 섭취하는 모유에는 vitamin A, C, E, superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase 등의 항산화 성분이 많이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다(Seo, 2010; Xavier et al., 2011). 따라서 신생아의 경우, 출생 후 면역 및 항산화에 필요한 모유를 섭취하는 것이 권장되므로 본 연구는 출산경과일에 따른 모유의 항산화 효능에 대한 차이를 분석하기 위해 수행되었다.

출산경과일 별 모유의 DPPH radical 소거능을 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 대조군인 0.1% vitamin C의 DPPH radical 소거능은 96.65±0.52%, 수집한 모유에서는 출산경과일이 30일 이상인 모유가 63.72±12.24%로 가장 높게 나타났으며, 다음으로는 10일 이상 30일 미만 모유가 60.51±11.10%, 10일 미만의 모유가 57.27±4.00%로 나타났으나 유의한 차이는 없었다(p>0.05).

Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of human breast milk according to the lactation stage. □; 0.1% vitamin C, ■; human breast milk samples. Data are expressed the mean±SD of human breast milk samples of mothers who followed the lactation stages. No statistical difference among groups was found by one-way ANOVA coupled with Duncan's multiple range test (p<0.05).

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Ramiro-Cortijo 등(2020)에 의하면 포화지방산 함량이 초유보다 성숙유에서 더 높은 것으로 보고되었다. 또한 기간이 오래될수록 포화지방산인 palmitic acid(C16:0), capric acid(C10:0), lauric acid(C12:0), myristic acid(C14:0)와 불포화지방산인 linoleic acid(C18:2n-6), α-linolenic acid(C18:3n-3)의 함량과 비율이 크게 증가하거나 안정적으로 유지되며, arachidonic acid(C20:4n-6)와 docosahexaenoic acid(DHA, C22:6n-3), eicosapentaenoic acid(EPA, C20:5n-3)의 감소됨이 보고된 바 있다(Bobiński and Bobińska, 2020; Floris et al., 2020; He et al., 2021). 포화지방산의 탄소사슬 수에 비례하여 DPPH radical 소거능이 높아지는 Han 등(2008)의 연구결과와 비교해볼 때, 본 연구에서 측정한 모유의 DPPH radical 소거능 결과는 모유 내 지방산 함량에 의한 것으로 추측된다.

건강한 여성의 모유에는 세균이 존재하고, 산모의 유선관을 통해 외부로부터 미생물이 유입되거나, entero-mammary pathway를 통해 소화관에 의해 기인하여 모유 내 미생물이 존재하는 것으로 알려져 있다(Fernándeza et al., 2013; Jost et al., 2015). 또한 모유의 미생물은 출산경과일, 분만 형태, 산모의 건강상태 또는 비만도, 화학적 치료 여부 등의 요인에 의해 영향을 받을 수 있다고 보고 있다(Lee and Kim 2019). 따라서 모유의 항용혈 효과를 확인하기에 앞서 본 연구에서는 모유의 용혈성 유무를 확인하여 비교하였다. 그 결과, 자연분만 11개 모유시료 중 8개(72.73%), 제왕절개 18개 모유시료 중 8개(44.44%)에서 약한 용혈성을 나타내는 박테리아 집락이 관찰되어, 제왕절개보다 자연분만 모유시료에서 상대적으로 더 높은 비율의 용혈이 확인되었다(Fig. 2). 또한 용혈이 확인된 16개의 모유시료 중 출산경과일이 10일 미만인 시료는 4개(25.00%), 10일 이상 30일 미만의 시료는 10개(62.50%), 30일 이상의 시료는 2개(12.50%)로 10일 이상 30일 미만의 시료에서 가장 높은 비율로 용혈이 확인되었다.

Fig. 2. Hemolysis of human breast milk samples.

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모유에서 발견되는 가장 흔한 박테리아는 Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Lactococcus, Enterococcus 및 Lactobacillus 속 등이 있다(Jost T et al., 2013; Witkowska and Kaminska, 2017). 그 중 Staphylococcus, Pseudomonas, Enterococcus 속은 hemolysin을 생성하여 용혈을 일으키는 것으로 보고된 바 있어(Bhakdi et al., 1988; Braïek and Smaoui, 2019; May et al., 2000; Oh et al., 2020; Schwan et al., 2003), 본 연구에서 수집된 모유의 용혈성은 이러한 균주에 의해 용혈성을 보이는 것으로 추정되며, 모유 내 미생물은 분만 형태, 출산경과일 및 약물복용 등의 화학적 치료 여부에 따라 달라질 수 있음이 보고된 바, 본 연구결과 또한 이러한 원인에 기인한 것으로 판단된다.

S. aureus와 P. aeruginosa가 분비하는 α, β-hemolysin은 감염된 동물 모델에서 중요한 독성 인자로 작용하여 여러 임상에서 독성을 강화하는 것으로 보고되었다(Bhakdi et al., 1988; May et al., 2000; Schwan et al., 2003). 따라서 박테리아가 생산하는 hemolysin에 의한 신생아의 용혈질환을 예방하기 위해, S. aureus CCARM 3855, P. aeruginosa CCARM 0223가 유발하는 용혈에 대한 모유의 억제효과를 확인하였다.

그람 양성균인 S. aureus CCARM 3855에 대한 모유의 항용혈 효과가 그람 음성균인 P. aeruginosa CCARM 0223에 대한 항용혈 효과보다 우수하였으며, 모유의 pH가 가장 높고, 건조중량이 가장 높았던 10일 미만의 모유시료에서 모두 가장 우수한 결과를 보였다(Fig. 3).

Fig. 3. Anti-hemolytic activity of human breast milk according to the lactation stage against S. aureus CCARM 3855 and P. aeruginosa CCARM 0223. ■ ; S. aureus CCARM 3855, □ ; P. aeruginosa CCARM 0223. Data are expressed the mean±SD of human breast milk samples of mothers who followed the lactation stages. No statistical difference among groups was found by one-way ANOVA coupled with Duncan's multiple range test (p<0.05).

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출산경과일에 따른 모유의 항용혈 효과를 확인한 결과, S. aureus CCARM 3855의 경우 출산경과일이 10일 미만인 모유시료가 66.37±21.36%로 가장 높았으며, 다음으로는 30일 이상이 53.48±22.03%, 10일 이상 30일 미만이 50.42±22.13% 순으로 유의한 차이는 없었다(p>0.05). 또한 P. aeruginosa CCARM 0223의 경우 10일 미만인 모유시료가 29.74±9.31%로 가장 높았으며, 다음으로는 10일 이상 30일 미만이 21.68±12.96%, 30일 이상이 21.14±7.77% 순으로 나타났으나 유의한 차이는 없었다(p>0.05).

모유의 항용혈 효과는 신생아의 발달, 보호, 항암, 항염증 및 항산화 등 생물학적 기능에 대해 광범위하게 연구된 모유 내 지방, 장쇄 다중 불포화지방산(long chain polyunsaturated fatty acids), 단백질 및 다양한 세포성분에 의한 것으로 추정할 수 있다(Kim and Yi, 2020; Ramiro-Cortijo et al., 2020; Witkowska and Kaminska, 2017). 본 연구결과를 통해 박테리아가 유발하는 신생아의 용혈질환에 대한 모유의 예방효과가 입증되어 추후 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.