한우 골격근 유래 고순도 근육 세포의 효율적 분리를 위한 최적화된 Pre-Plating 프로토콜

충청북도 청주시 청원구에 위치한 팜스토리한냉 중앙공장에서, 각각 33, 34개월령의 한우 거세우에서 우둔살을 채취하였다. 동물의 사육 및 처리 과정은 충북대학교 동물실험윤리위원회 (IACUC)의 심의를 거쳐 승인된 절차에 따라 이루어졌다(승인번호: CBNUA-2107-23-01).

근육조직은 한우로부터 채취하였으며, 채취한 조직은 냉장 상태로 실험실로 옮겨 실험에 이용되었다. 과도한 지방과 결체조직을 제거한 뒤 조직을 미세하게 절단하고, collagenase type II(600 units/mL) Worthington, Lakewood, NJ, USA, Cat # LS004176)와 3% penicillin-streptomycin-amphotericin B(PSA)가 함유된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco, Cat # 11995065) 배지에 35 mL당 10 g의 조직을 첨가하여 37℃ water bath에서 30분간 효소처리하였다. 이후 피펫팁으로 여러 차례 조직을 혼합하며 해리 유도한 후 40 μm 나일론 메시 필터를 이용하여 여과하였다. 두차례 원리분리(70 ×g, 5 min; 펠렛, 800 ×g, 5 min; 상층액) 후 ACK(Ammonium-Chloride-Potassium) lysis buffer를 이용하여 적혈구를 제거하였다. 수집된 세포는 세포 수의 확보와 불순물 제거를 위해 2회 계대배양하였으며, F10(Ham’s F10 nutrient mix, Gibco, Cat # 11550043) 배지에 20% FBS, 1% PSA를 첨가한 조건에서, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하여 이후 실험에 사용하였다.

섬유아세포와 근육 위성세포의 부착 속도 차이를 이용한 pre-plating 방법을 통해 근육 위성세포를 분리하였다. Passage 2 cell을 콜라겐 코팅 플라스크에 분주하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 1시간 동안 배양하였으며, 이때 부착된 세포들을 CT(control treatment)라고 명명하였다. 이후 부착된 세포를 Matrigel 코팅 플라스크로 옮겨 4일 동안 배양하였다. 70∼80% confluent 후, Trypsin-EDTA로 세포를 분리하여 콜라겐 코팅 플라스크에 다시 분주하고 5분간 배양하였다. 쉐이킹한 후 상층액을 회수하여 콜라겐 코팅 플라스크(CS)에 접종하였고, 부착세포를 Trypsin-EDTA로 회수한 후 상온에서 5분간 가온하고 부드럽게 쉐이킹하는 과정을 5회 반복하였다. 남아 있던 세포는 그대로 마트리젤 코팅 플라스크(CF)에 부착하여 최종 세포 집단을 3일 동안 배양하여 분석하였다(Fig. 1)(Yoshioka et al., 2020).

Fig. 1. Schematic illustration of the pre-plating method for selective enrichment of bovine satellite cells through differential adhesion and gentle shaking. CT: control treatment; CS: satellite cells; CF: fibroblast cells.

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증식이 완료된 세포는 4% paraformaldehyde 용액에서 37℃로 45분간 고정한 후, 잔여 고정제를 제거하기 위해 PBS(Phosphate-buffered saline)로 10분씩 두 차례 세척하였다. 이후 세포막 투과를 위해 0.1% Triton X-100(PBS 기반)을 상온에서 20분간 처리하였다. 투과 처리 후 2% bovine serum albumin(BSA) 용액을 이용하여 비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 30분간 blocking을 실시한 뒤 PBS로 세척하였다. 이후 증식된 세포를 각각 2% BSA에 1:100으로 희석한 일차 항체 Pax7(PA5-68506, Invitrogen, USA), MYOD1, Vimentin, 및 PDGFa와 반응시키기 위해 각 well에 분주하고, 4℃에서 overnight incubation을 수행하였다. 항체 결합 후 잔여 항체 제거를 위해 0.05% Tween-20(PBS 기반)으로 10분간 세척하였다. 이후 1:100으로 희석한 cross-adsorbed anti-rabbit IgG(A21121, Invitrogen)를 사용하여 상온에서 30분간 2차 항체 반응을 진행하였다. 핵 염색은 Hoechst 33342(1:2000; H3570, Invitrogen)를 처리하여 실시하였고, 이후 PBS로 세척하여 잔여 염색 물질을 제거하였다. 모든 처리 과정이 완료된 세포는 형광현미경을 이용하여 이미지를 획득하였다. 이미지 분석은 ImageJ 소프트웨어를 통해 진행하였으며, 이미지 분석 및 핵 수를 계수하였다.

부착 속도에 맞춰 배양된 세포는 TRIzol 시약을 이용하여 플라스크에서 회수하였고, 이를 정량적 유전자 발현 분석을 위한 샘플로 이용하였다. 총 RNA는 iNtRON Biotechnology(Seongnam, Korea)에서 제공하는 Total RNA Extraction Kit를 이용하여 분리하였으며, 추출된 RNA는 Thermo Fisher Scientific의 역전사 키트를 제조사의 프로토콜에 따라 처리하여 cDNA로 합성하였다. 유전자 발현 정량 분석은 RT-qPCR 방법을 이용하여 SYBR Green 시약(ELPIS-BIOTECH, Daejeon, Korea)과 Table 1에 제시된 primer를 사용하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 50℃에서 2분간 초기 반응 후, 95℃에서 10분간 초기 변성 과정을 거쳤으며, 이후 95℃에서 15초, 52∼55℃에서 1분간의 반응을 40회 반복하여 증폭하였다. 유전자 발현 정량은 2⁻^ΔΔCt 방식으로 계산하였다(Livak and Schmittgen, 2001).

모든 데이터는 평균과 표준편차로 표기하였으며, 실험은 총 3회 이상 반복하여 실험을 진행하였다. 통계 분석은 SAS program(version 9.4; SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)의 General Linear Model (GLM) procedure를 이용하여 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 후 Duncan’s multiple range test로 사후검정을 수행하였다. GLM 분석은 control treatment(CT) 그룹에서의 PAX7 양성 핵수와 Vimentin(VIM) 양성 핵수 비교(Fig. 3), CS 및 CF 처리구 간 PAX7 양성 핵수 비교(Fig. 4), CS 및 CF 처리구 간 VIM 양성 핵수 비교(Fig. 5), 그리고 CS 및 CF 그룹에서 RT-qPCR로 측정한 PAX7, MYOD1, VIM 및 PDGFA 유전자의 상대적 발현량 비교(Fig. 6)에 적용하였다. 모든 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 판단하였다.

Fig. 2. Morphological comparison of cell populations according to preplating duration (Day 3 of culture). The images were taken at 40× magnification. Scale bar is 100 μm. CT: collagenase total cells, CS: collagenase satellite cells, CF: collagenase fibroblasts.

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Fig. 3. Immunofluorescence staining of satellite cell markers in cultured cells under different preplating conditions. The images were taken at 100× magnification. Scale bar is 100 µm. Cells were stained with antibodies against PAX7, VIM (green) and nuclei were counterstained with DAPI (blue). Representative images show the distribution and abundance of PAX7- and VIM- positive cells. CT: collagenase total cells.

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Fig. 4. Immunofluorescence staining of satellite cell markers in cultured cells under different preplating conditions. The images were taken at 100× magnification. Scale bar is 100 µm. Cells were stained with antibodies against PAX7 (green), and nuclei were counterstained with DAPI (blue). Representative images show the distribution and abundance of PAX7- positive cells. CS: collagenase satellite cells, CF: collagenase fibroblasts. ^a∼b Values are presented as mean±standard deviation. Different letters indicate significant differences (p<0.05).

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Fig. 5. Immunofluorescence staining of satellite cell markers in cultured cells under different preplating conditions. The images were taken at 100× magnification. Scale bar is 100 µm. Cells were stained with antibodies against VIM (green) and nuclei were counterstained with DAPI (blue). Representative images show the distribution and abundance of VIM- positive cells. CS: collagenase-isolated satellite cells, CF: collagenase-isolated fibroblasts. ^a∼b Values are presented as mean±standard deviation. Different letters indicate significant differences (p<0.05).

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Fig. 6. mRNA expression levels of satellite cell markers in cultured cells under different preplating conditions. Reverse transcription–quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis of PAX7, MYOD1, VIM, and PDGFA was performed after 3 days of culture. Gene expression levels were normalized to the GAPDH. CS: collagenase satellite cells; CF: collagenase fibroblasts. ^a∼b Values are presented as mean + standard deviation. Different letters indicate significant differences (p<0.05).

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CT 그룹에서는 근육세포와 섬유아세포가 혼재된 형태로 관찰되었으며, 배양 기간 동안 다양한 형태의 세포들이 불균일한 집락을 형성하였다. CS 및 CF 그룹 역시 세포 형태에서 일부 차이가 관찰되었으나, 형태학적 관찰만으로는 위성세포와 섬유아세포를 명확히 구분하기는 어려웠다(Fig. 2). 이러한 결과는 pre-plating 과정에 따른 세포 부착 특성의 차이가 형태학적 특성보다는 분자적 표지자의 분석을 통해 보다 명확히 확인될 필요가 있음을 시사한다.

Fig. 3은 CT 그룹에서 PAX7 및 Vimentin(VIM)에 대한 면역형광 염색을 각각 수행한 결과를 나타낸 것이다. PAX7 면역형광 염색에서는 PAX7 양성 핵이 관찰되었으며, VIM 염색에서도 VIM 양성 핵이 확인되었다. 각 마커에 대해 독립적으로 핵 수를 계수한 결과, CT 그룹 내에서 PAX7⁺ 핵과 VIM⁺ 핵이 모두 존재하는 것으로 나타났으며, 이는 콜라게나아제 처리 후 획득된 초기 세포 집단이 근육위성세포와 섬유아세포가 혼재된 이질적인 세포 집단임을 시사한다. 이러한 결과는 초기 세포 집단으로부터 특정 세포군을 정제하기 위해 pre-plating 과정이 필요함을 뒷받침한다. CS와 CF 그룹의 PAX7과 VIM 발현 비교는 각각 Fig. 4 및 Fig. 5에 나타내었다. CS 그룹 내에서 PAX7⁺ 핵이 CF 그룹에 비해서 현저하게 많은 것을 확인하였다(p<0.05, Fig. 4). 이는 pre-plating 과정을 통해 근육 위성 세포가 효과적으로 분리되었음을 보여준다. 반면에 CF 그룹은 VIM 양성 세포가 다수를 차지하였으며, CS 그룹은 VIM⁺ 핵이 현저히 적은 것을 확인할 수 있었다(p<0.05, Fig. 5). 이는 섬유아세포가 CF 그룹으로 분리되었음을 의미하며, 동시에 CS 집단의 위성 세포 순도가 높음을 뒷받침하는 결과로 사료된다. 따라서 개발된 pre-plating 방법은 근육 위성세포와 섬유아세포를 모두 확보할 수 있는 유용한 기술인 것으로 판단된다. 특히, PAX7⁺ 위성세포의 분화 조절과 기질세포와의 상호작용이 근육 재생의 기능적 조절에 중요하다고 보고한 기존 연구와 비교할 때, 본 연구에서 확립된 CS 및 CF 집단의 분리 전략은 세포 유형별 기능적 특성 분석에 유용한 실험적 플랫폼을 제공할 것으로 사료된다(Yoshioka et al., 2020).

Fig. 6은 CS 및 CF 그룹의 유전자 발현 분석 결과로, 대표적인 근육세포 마커 (PAX7, MYOD1)와 섬유아세포 마커(VIM, PDGFA)의 발현 수준을 비교한 결과이다. 근육 위성세포 마커인 PAX7과 근육 분화 관련 전사인자인 MYOD1의 발현은 CS 그룹에서 CF 그룹에 비해 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). 특히 MYOD1은 근육 분화 초기 단계에서 위성세포의 분화 개시를 조절하는 핵심 전사인자로 알려져 있으며, CS 그룹에서의 높은 발현은 근육 분화 잠재력이 유지되고 있음을 시사한다(Hindi et al., 2013). 반면에 섬유아세포 마커인 VIM과 성장인자 관련 유전자인 PDGFA에서는 CF 그룹에서 CS 그룹에 비해 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). 이는 CF 그룹이 섬유아세포의 특성을 보다 강하게 나타내며, 세포외기질 형성 및 기질 리모델링 능력이 강화된 상태로 분리되었음을 의미한다. CS 그룹에서 PAX7과 MYOD1 발현이 동시에 높게 나타난 것은 위성세포의 자기 재생능과 근육 분화 잠재력을 보존하고 있음을 보여준다. 이러한 특성은 향후 근육 분화 기작 연구뿐만 아니라 세포 배양육 생산을 위한 근육세포 원료로서의 활용 가능성을 시사한다. 반면, CF 그룹은 섬유아세포가 세포외기질 형성 및 미세환경 조절에 기여하는 특성을 나타내어, 조직 재생 또는 세포 상호작용 연구를 위한 모델로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.