Ⅰ. 서 론
Bacillus cereus는 그람양성의 간균으로 포자를 형성하는 식중독 세균 중 하나이며(Guinebretiere et al., 2010; Yu et al., 2014), 증상은 설사형 또는 구토형의 위장 질환이 있다(Arnesen et al., 2008; Voort and Abee, 2013). 설사 증상은 소장의 상피세포의 원형질막에서 hemolysin BL(HBL) 및 비용혈성 장독소(nonhemolytic enterotoxin, Nhe), 세포독성 K(cytotoxin K, Cytk)와 같은 단백질 장독소의 수평 유전자 전달로 인해 발생한다(Arnesen et al., 2008; Schoeni and Wong, 2005; Voort and Abee, 2013). 구토 증상은 구토 독소 유전자인 ces 유전자를 가진 B. cereus가 생성한 cereulide에 의해 발병된다(Hoton et al., 2005; Rajkovic et al., 2008; Voort and Abee, 2013). Rajkovic 등(2008)의 연구에 따르면, 구토 독성인자인 cereulide는 열 안정성이 높아 열에 의해 독성의 활성 손실이 유발되지 않으며, 매우 높은 pH(pH 9.5)에서 121-150℃에 일정 시간 이상(60-80분) 노출될 때만 비활성화되는 것으로 확인되었다.
이러한 장독소 및 독소 유전자로 인한 B. cereus 식중독 사고를 저해하려면 그에 맞는 적절한 관리가 필요하다. 식품업계에서는 식품 제조·가공 시 수행되는 열처리, 동결, 건조 등의 일련의 절차 를 통해 세균의 증식을 억제하거나 사멸시킨다(Mukhtar et al., 2020). 그러나 대표적인 포자형성균 중 하나인 B. cereus는 내열성이 강하고 식품에 부착되는 능력이 높아 상업적 살균으로 식중독 발생의 위해를 감소시키기에 어려움이 있다(Faille et al., 2002; Luksiene et al., 2009; Stalheim and Granum, 2009; Vilain et al., 2006). Pereira 등(2019)은 B. cereus는 고온(140℃)에서 장시간의 로스팅을 했을 때에도 적절한 세균 수 감소가 이루어지지 않았다고 보고하였다.
식중독 세균은 토양 및 식물, 곤충 등 다양한 매개체를 통해 식품에 유입될 수 있다(Arnesen et al., 2008). 토양에 내포된 세균이 작물 표면으로 이행되고, 그로 인해 부착된 세균이 식중독 발생을 유발한다는 점을 생각해 볼 필요가 있다. 토양에는 여러 영양성분 및 유기물뿐만 아니라 식중독 세균이 존재할 수 있으며, 식중독 세균 중 건조한 환경에서도 포자 형성을 통해 생존이 가능한 Bacillus spp.가 빈번하게 검출 된다(Yu et al., 2014). Yu 등(2014)은 토양에서 분리된 세균의 유전적 식별을 통해 총 136개의 균주를 확인하였으며, 그 중 79개는 Bacillus spp.에 속했고, Bacillus subtilis(n=32), Bacillus pumilus(n=14), B. cereus(n=4) 등이 분리되었다고 보고하였다.
토마토(Lycopersicon esculentum)는 세계에서 가장 많이 재배되는 원예작물 중 두 번째를 차지하는 작물로, 대부분 토양 재배가 주를 이룬다(FAOSTAT, 2001). 2001년 기준, 세계 생산량은 국가별로 최소 370만 톤에서 최대 1억 톤으로, 경제적으로 중요한 작물이며(FAOSTAT, 2001), 온도, 습도, pH, 염도 등의 조건에 따라 생산량이 기하급수적으로 증가하기 때문에 재배가 용이하지만 토양과 밀접하게 자라는 재배조건에 따라 Bacillus spp.의 부착에 의한 식중독 사고가 우려되는 작물이다(Mukhtar et al., 2020). Frentzel 등(2020)에 따르면 426개의 생토마토에서 B. cereus를 분석하였으며, 그 결과 28%의 시료에서 B. cereus가 검출된 것으로 확인되었다.
따라서 본 연구의 목적은 토양이 감염원이 되어 발생하는 식중독 발생 우려에 따라 토마토 농가의 환경에서 분리된 B. cereus를 파악하고, 일정 온도에서의 지속적인 열처리에 따른 시간별 불활성화 정도를 측정하여 B. cereus의 열 저항성을 확인하는 것이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
광명 지역에 위치한 토마토 농가의 재배환경, 포장·저장, 수확, 육모·재배 등 각 단계에서 16개의 환경 시료(토양, 양액, 화장실 손잡이, 작업대 등)를 채취하여 B. cereus를 분리하였다. 19개의 B. cereus 의심 집락 중 16s rRNA sequencing 분석을 통해 최종 확인된 B. cereus 14개에 한하여 실험을 진행하였다(Table 1). 획선도말의 형태로 냉장보관하였던 14개의 B. cereus의 단일 집락을 이용하여 접종액을 준비하였다. 각 균주는 Tryptic Soy broth(TSB; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MN, USA)에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하여 활성화 시켰다. 활성화된 균주를 새로운 TSB에 동일한 조건으로 계대 배양한 후, 15 mL conical tube에 옮겨 1,912 × g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 세척하였다. 상층액을 제거하고 phosphate-buffered saline(PBS; pH 7.4; KH2PO4 0.2 g, Na2HPO4·7H2O 1.5 g, NaCl 8 g, KCl 0.2 g/멸균증류수 1 L)을 세균액과 동량으로 가한 뒤 균체를 현탁시켰다. 이 과정을 2회 반복하였으며, PBS를 이용하여 현탁액을 6-7 Log CFU/mL 수준으로 적절히 희석하여 접종액으로 사용하였다.
B. cereus의 열저항성을 분석하기 위하여 클린벤치 내에서 앞서 준비한 접종액 중 1 mL를 사전에 항온수조에서 60℃로 데워진 9 mL의 TSB에 접종하였다. 접종 직후 시료를 혼합하여 1 mL를 취한 뒤 9 mL의 0.1% buffered peptone water(BPW; Becton, Dickinson and Company)를 이용하여 적절히 십진희석하였다(0 min). 시료는 1 mL를 취한 후 즉시 60℃ 항온수조에 넣어 최대 60 min까지 열을 가하였다. 십진희석한 희석액을 0.1 mL씩 취하여 Tryptic Soy Agar(Becton, Dickinson and Company)에 분주하고 평판도말을 실시하였다. 20분 간격으로 항온수조에 있는 시료를 꺼내어 동일한 방법으로 평판도말한 후, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 집락을 계수하고 아래의 계산식에 따라 집락 수를 계산하였다. 열저항성 분석은 2회 반복실험하였다.
Ⅲ. 결과 및 고찰
열저항성 분석 결과, 0 min에서 60 min에 이르기까지 B. cereus 세균 수는 감소하는 패턴을 보였으며, 0 min에서 평균 5.3±0.2 Log CFU/mL(최소 5.0 Log CFU/mL, 최대 5.9 Log CFU/mL)이던 초기 세균수가 60 min에 평균 1.7±0.2 Log CFU/mL(최소 0.5 Log CFU/mL, 최대 2.4 Log CFU/mL)까지 감소하는 것으로 나타났다(Table 2). 0-20 min 구간은 급격한 감소가 발생하였으며, 평균 –2.9 Log CFU/mL(최소 –2.4 Log CFU/mL, 최대 –3.6 Log CFU/mL)의 감소를 확인할 수 있다. 초기 세균수(0 min)와 최종 세균수(60 min)의 결과만을 비교하면 평균 –3.6 Log CFU/mL 수준으로 감소했으며, 최소 감소 수준은 –2.8 Log CFU/mL(2번 B. cereus), 최대 감소 수준은 –4.7 Log CFU/mL(6번 B. cereus)로 나타났다(Table 3). 열저항성 결과, 균주 별로 열저항성에 차이가 있는 것으로 확인되었으며, 2번 균주는 6번 균주에 비하여 열저항성이 비교적 높은 것이라고 말할 수 있다.
B. cereus는 토양, 식물 등 자연계에 널리 존재할 수 있으며 토양에 접촉한 유기물 및 동물(숙주) 혹은 자발적인 포자 형성을 통해 식품으로 이행될 수 있다(Arnesen et al., 2008; Vilain et al., 2006). 또한 식품 가공 시 부적절한 세척 및 보관으로 식품에 부착된 세균이 교차오염될 가능성도 있다. 그로 인해 가공식품 및 식품 생산 기기에 식중독 세균이 검출될 수 있으며(Vilain et al., 2006), 포자형성균의 경우 외부 스트레스에 저항하는 능력이 강한 포자로 인해 전 식품 생산 라인의 정기적인 청소로도 사멸시키기 어려워 식중독 사고 발생의 위험이 높다(Faille et al., 2001; Vilain et al., 2006).
본 연구에서는 열로 인한 B. cereus 생균수의 감소를 확인하였으나, 생균수가 더 이상 감소하지 않고 유지되는 구간을 확인할 수 있었다. 이러한 것을 tail effect라고 하며, tail effect는 불활성화 후의 잔여 생균수가 무한대로 향하는 것으로(Koutsoumanis et al., 1999), 잔여 생균수가 적을지라도 세균의 recovery 기전으로 인하여 식품을 부적절한 환경(예: 상온)에 방치할 때 세균 증식으로 인한 식중독 사고 발생의 위험을 야기시킬 수 있다. 불활성화 처리 이후 생존한 세균은 그 특성에 맞는 영양성분이 공급될 시 정상적으로 자랄 수 있다고 알려져 있다(Dabbah et al., 1969). 또한 Kragh 등(2022)은 열을 통해 건조된 버섯에서의 B. cereus 성장을 확인하였으며, 열처리를 통해 불활성화 되었던 B. cereus가 가정 내에서 재수화되는 과정에서 성장하는 것을 보여주었다. B. cereus의 doubling time은 20-60분이며, 최소감염량(infectious dose)은 대략 105 CFU/g(또는 mL)로 알려져 있다(Frentzel et al., 2020). Doubling time을 20분이라고 가정하였을 때, 열 저항성이 가장 큰 것으로 확인된 2번 B. cereus는 60℃에서 열처리를 60분 동안 하더라도 잔여 생균수가 200여분 만에 식중독을 유발시킬 수 있는 수준까지 생장할 수 있다.
그러므로 B. cereus의 식품 유입 방제를 위해서는 해당 세균에 대한 주의가 필요하다. 현재 식품 위생에 대한 소비자의 인식은 높아지고 있으며, 위생 관리에 대한 지식을 습득하여 자발적인 위생관리에 초점을 두고 식품을 통한 식중독 사고 감소를 중요하게 보고 있다. 따라서 식품 업체의 꾸준한 모니터링과 자발적인 위생관리를 통해 식품 매개 식중독 사고의 절감과 식품 안전성을 확보할 수 있는 각고의 노력이 필요하다.
Ⅳ. 요 약
B. cereus는 식품 표면에의 접착능이 높고 대표적인 포자형성균으로 특히 포자는 내열성이 있어 식품업체의 상업적 멸균을 통해서도 제어하기 어렵다. 본 연구에서는 토마토 농가 환경에서 분리된 14개의 B. cereus를 60℃에서 60분 동안 열처리하면서 시간별 B. cereus의 불활성화 정도를 도출하여 B. cereus의 열저항성을 확인하였다. 그 결과, 60분 동안 열처리 후 감소된 B. cereus 세균수는 평균 –3.6 Log CFU/mL(최소 –2.8 Log CFU/mL, 최대 –4.7 Log CFU/mL)로 나타났다. 열처리 후 잔존하는 B. cereus 생균수는 최소 0.5 Log CFU/mL, 최대 2.4 Log CFU/mL로 확인되었다. 열처리 후 잔존하는 B. cereus는 생육하기에 적합한 환경이 되면 recovery되어 생장 가능하며, 이는 B. cereus 식중독 발생의 원인이 될 수 있다. 농산물의 재배단계에서 농가 환경에 존재하는 B. cereus는 다양한 경로(토양, 화장실 손잡이, 작업자 장갑 등)를 통해 농산물로 이행될 수 있기 때문에 농가 환경에서의 B. cereus의 관리는 필수적이다. 또한, 식품 가공단계에서의 부적절한 살균·제조·가공·포장 등은 식중독 세균의 온전한 생육 억제를 기대할 수 없고, 식중독 발생 위험을 높일 수 있으므로 이러한 공정에 대한 식품 업체의 철저한 관리가 중요하다고 판단된다.
