흑미 가루를 첨가한 요거트의 항산화 활성과 품질 특성

지역 마트에서 구매한 우유 (Seoul milk, Korea)에 플레인 요거트 (Maeil, Korea)를 접종하여 37℃에서 16시간 발효하여 요거트를 제조하였다. 이때 사용된 플레인 요거트에는 9 log CFU / 85 mL의 Lactobacillus rhamnosus GG이 함유되어 있는 것을 사용하였다. 제조된 요거트에 흑미 가루 (Jindo, Korea)을 각각 0%, 5%, 10%, 15%를 혼합하여 4℃에서 24시간 발효 후 냉장 보관하면서 실험을 진행하였다.

pH는 시료 3 g을 채취, 증류수 12 mL와 혼합하여 ultra turrax (HMZ-20DN, Poonglim Tech, Korea)로 8,000 rpm에서 1분간 균질한 후 유리전극 pH meter (Model S220, Mettler-Toledo, Switzerland)를 이용하여 측정하였다.

색도는 colorimeter (CR-10, Minolta, Japan)를 사용하여 명도 (lightness)를 나타내는 CIE L^* 값, 적색도 (redness)를 나타내는 CIE a^* 값 그리고 황색도 (yellowness)를 나타내는 CIE b* 값을 측정하였다. 이때의 표준색은 CIE L* 값은 +97.83, CIE a* 값이 -0.43, CIE b* 값이 +1.98인 백색 표준판을 사용하였다.

유산균 생균수의 변화는 시료 5 mL를 채취하여 십진 희석법으로 멸균 생리식염수에 희석한 뒤, Lactobacilli MRS Agar 배지 (BD Difco, Fraklin Lakes, USA)에 평판 도말 후 37℃에서 48시간 배양하였다. 그 후 생성된 군집수를 측정하여 log CFU (colony forming unit)/mL로 나타내었다.

총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 방법 (Singleton and Rossi, 1965)을 적용하여 측정하였다. 추출액 40 μL와 2 N Folin-Ciocalteu 용액 80 μL를 혼합하여 3분 동안 반응시킨 후 20% Na₂CO₃를 800 μL 추가하고 빛을 차단하여 37℃ 암실에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 Multi-mode microplate reader (SpectraMax iD3, Molecular Devices, USA)를 사용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. Garlic acid를 표준물질로 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석 후 얻은 검량선으로 총 페놀함량을 산출하였다.

총 플라보이드 함량은 Woisky와 Salatino (1998)의 방법을 적용하여 측정하였다. 추출액 100 μL에 diethylene glycol 1 mL와 1 N NaOH 100 μL를 혼합한 다음 빛을 차단하여 37℃ 암실에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 Multi-mode microplate reader를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. Naringin을 표준물질로 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석 후 얻은 검량선으로 총 플라보노이드 함량을 산출하였다.

Free radical 소거능은 메탄올에 용해한 0.2 mM 2,2 diphenyl-1 carboxylic acid 1 mL와 추출물 1 mL를 혼합하고, 암실에서 실온으로 30분간 반응시켰다. 이후 Multi-mode microplate reader를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하여 다음과 같은 식을 통하여 백분율로 나타내었다.

환원력은 Benzie와 Strain (1996)의 방법을 적용하여 측정하였다. FRAP 시약은 사용하기 전에 0.3 M sodium acetate buffer와 40 mM HCl에 녹인 10 mM TPTZ, 20 mM FeCl₃를 10:1:1의 비율로 섞어 37℃에서 15분 반응시켜 준비하였다. 제조된 FRAP 시약 3 mL와 시료 추출물 1 mL를 혼합하여 빛을 차단한 37℃ 암실에서 15분간 반응시킨 후 Multi-mode microplate reader를 이용하여 593 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험의 결과는 최소한 3회 이상의 반복실험을 실시하여 평가되었다. 이후 통계처리 프로그램 SAS (Version 9.3 for Window, SAS Institue Inc., USA)를 이용하여 결과를 평균값과 표준편차로 나타내었으며, one way ANOVA, Duncan's multiple range test로 각각의 특성에 대해 유의적인 차이가 있는지를 검증하였다.

요거트의 제조 시 유산균에 의해 우유를 응고시키고 잡균의 증식을 막기 위해 우유의 pH를 저하시키게 되는데, 제조된 요거트의 pH는 4.3에서 4.5 사이를 기준으로 삼고 있다 (Seo, 2011). 흑미 가루 첨가량에 따른 요거트의 pH와 색도는 Table 1에 나타내었다. pH는 흑미 가루 4%와 6% 첨가한 처리구가 대조구보다 유의적으로 높은 값을 보였다 (p<0.05). 이는 사용된 흑미 가루의 pH가 6.68로 요거트보다 높기 때문에 첨가량이 증가함에 따라 pH 또한 증가한 것으로 사료된다 (Park and Kim, 2016).

명도는 흑미 가루 첨가량이 증가할수록 유의적으로 감소했지만 (p<0.05), 적색도는 흑미 가루 첨가량이 증가할수록 유의적으로 증가하였다 (p<0.05). Lee와 Oh (2006)는 흑미 가루 첨가량이 증가할수록 명도는 감소하고 적색도는 증가한다고 보고하여 본 연구 결과와 유사하였다. 이는 흑미의 주요 색소인 cyaniding 3-glucoside와 malvidin-3-glucoside가 적색을 나타내기 때문에 이와 같은 결과를 나타낸 것으로 사료된다 (Jung et al., 2002). 황색도는 흑미 가루 4%와 6% 첨가한 처리구가 대조구와 흑미 가루 2% 첨가한 처리구보다 유의적으로 낮은 값을 나타내었다 (p<0.05). 이는 Lee 등 (2018)의 흑미를 첨가한 아이스크림 연구에서도 흑미를 첨가할수록 명도와 황색도는 감소하고 적색도는 증가한다고 보고하여 본 연구에서도 첨가된 흑미 가루에 의해 명도와 황색도는 감소하고 적색도는 증가한 것으로 판단된다.

Fig. 1은 흑미 가루 첨가량에 따른 요거트의 유산균 생균수를 측정한 결과이다. 흑미 가루 4%와 6% 첨가한 처리구가 대조구와 흑미 가루 2% 첨가한 처리구보다 유의적으로 높은 값을 보였다 (p<0.05). Demirci 등 (2017)은 쌀 미강을 요거트에 첨가하게 되면 Lactobacillus와 Streptococcus의 생균수가 증가한다고 보고하여 본 연구 결과와 유사하였다. 이는 흑미에 미생물의 필수 영양소인 식이섬유, 철, 망간 등이 풍부하고 유산균은 다른 병원성 박테리아보다 영양소 대사 속도가 높아 이러한 결과를 나타낸 것으로 사료된다 (Agil et al., 2013). 또한 식품공전의 유가공품 기준 규격에 의하면 발효유의 총 유산균 수 기준은 10⁷ CFU/mL 이상이며, 본 연구에서 제조한 모든 요거트는 10⁸ CFU/mL 이상으로 기준에 적합하였다 (Hyun et al., 2020). 따라서 요거트에 흑미를 첨가하는 것은 프로바이오틱스 유제품을 제조하는데 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단된다.

Fig. 1. Viable cell count of yoghurt formulated with various levels of black rice flour. ^a-c Means on bars with different letters are significantly different (p<0.05). Con: yoghurt without black rice flour, B2: yoghurt with 2% black rice flour, B4: yoghurt with 4% black rice flour, B6: yoghurt with 6% black rice flour.

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최근 프로바이오틱스 유제품들은 균주의 먹이인 프리바이오틱스로 과일류와 곡물류를 함께 첨가하기도 하는데, 이는 제품의 페놀화합물, 플라보노이드, 식이섬유소 등과 같은 phytochemical을 증가시키는 요인이 된다 (Noh et al., 2020). Fig. 2는 흑미 가루 첨가량에 따른 요거트의 총 페놀 함량을 측정한 결과이다. 총 페놀 함량은 흑미 가루 첨가량이 증가할수록 유의적으로 증가하였다 (p<0.05). Kim 등(2013)은 유색미에는 다량의 페놀 화합물이 함유되고 있다고 보고하여 본 연구에서도 요거트에 흑미 첨가량이 증가할수록 함께 증가하는 결과를 보인 것으로 사료된다. 특히 흑미에는 과피색을 띠는 페놀 화합물인 안토시아닌이 다량 함유되어 있어 대조구와 처리구 간의 총 페놀 함량 차이가 크게 난 것으로 판단된다 (Park et al., 2016).

Fig. 2. Total polyphenol contents of yoghurt formulated with various levels of black rice flour. ¹⁾ GAE, gallic acid equivalent.^a-dMeans on bars with different letters are significantly different (p<0.05). Con: yoghurt without black rice flour, B2: yoghurt with 2% black rice flour, B4: yoghurt with 4% black rice flour, B6: yoghurt with 6% black rice flour.

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폴리페놀에 속하는 플라보노이드는 곡물과 과실류에도 분포하는데 쌀과 같은 경우 적색도와 양의 상관관계에 놓인 것으로 알려져 있다 (Shao et al., 2011). 흑미 가루 첨가량에 따른 요거트의 총 플라보노이드 함량은 Fig. 3에 나타내었다. 흑미 가루를 첨가한 처리구가 대조구보다 유의적으로 높은 값을 나타내었다 (p<0.05). Kim 등 (2020)은 흑미의 플라보노이드 함량은 폴리페놀 함량보다는 품종 간의 변이가 더 크게 작용한다고 보고하였으며, 또한 흑미는 도정을 하지 않을 경우 과피에 많은 페놀 화합물과 플라보노이드를 함유하고 있기 때문에 도정을 하지 않은 상태에서 흑미 가루를 제조하여 높은 플라보노이드 함량을 보인 것으로 사료된다 (Choi et al., 2018). 따라서 흑미 가루를 첨가하여 요거트를 제조할 경우 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 높은 제품을 제조할 수 있을 것으로 판단된다.

Fig. 3. Total flavonoid contents of yoghurt formulated with various levels of black rice flour. ¹⁾ NE, naringin equivalent. ^a-cMeans on bars with different letters are significantly different (p<0.05). Con: yoghurt without black rice flour, B2: yoghurt with 2% black rice flour, B4: yoghurt with 4% black rice flour, B6: yoghurt with 6% black rice flour.

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항산화 물질은 인체의 활성산소를 제거하고 식품의 산화를 억제하는데, 이러한 활성 산소를 제거하는 능력을 DPPH 라디칼 소거능이라 한다 (Musa et al., 2016). 흑미 가루 첨가량에 따른 요거트의 DPPH 라디칼 소거능 측정 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 흑미 첨가량이 증가할수록 DPPH 라디칼 소거능도 유의적으로 증가하였다 (p<0.05). Khalil과 Elkot (2020)의 흑미 가루를 첨가한 치즈에서도 흑미 첨가량이 증가할수록 DPPH 라디칼 소거능 또한 증가한다고 보고하여 본 연구 결과와 유사하였다. 이는 흑미가 다른 곡류에 비해 항산화 활성이 뛰어난 페놀화합물 함량이 높기 때문인데 (Cho et al., 2012), 본 연구에서도 총 페놀 함량이 증가할수록 DPPH 라디칼 소거능도 함께 증가하여 첨가된 흑미의 페놀이 영향을 준 것으로 판단된다.

Fig. 4. DPPH radical scavenging activity of yoghurt formulated with various levels of black rice flour. ^a-d Means on bars with different letters are significantly different (p<0.05). Con: yoghurt without black rice flour, B2: yoghurt with 2% black rice flour, B4: yoghurt with 4% black rice flour, B6: yoghurt with 6% black rice flour.

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FRAP은 ferric-ferricyanide (Fe³⁺) 혼합물이 수소를 공여하여 유리 라디칼을 안정화시켜 ferrous (Fe²⁺)로 전환하는 환원력을 측정한 것으로 DPPH 라디칼 소거과는 다른 항산화 활성 측정 방법이다 (Sa et al., 2010). Fig. 5는 흑미 가루 첨가량에 따른 환원력 측정 결과이다. 흑미 가루 6% 첨가한 처리구가 대조구와 다른 처리구들에 비해 유의적으로 가장 높은 값을 보였다 (p<0.05). 이는 사용된 흑미가 높은 페놀과 플라보노이드 함량을 지니고 있어 환원력 또한 높게 나온 것으로 사료된다 (Yang et al., 2015). Pengkumsri 등 (2015)은 흑미의 항산화 측정 결과 DPPH 라디칼 소거능과 환원력이 항상 양의 상관관계를 나타나지 않으며, 이는 품종과 처리방법에 따라 다른 수치를 보인다고 보고하였다. 따라서 요거트의 흑미 첨가는 높은 항상화 활성 능력을 지닌 건강 기능성 유제품을 제조할 수 있을 것으로 판단된다.

Fig. 5. Ferric reducing antioxidant power (FRAP) of yoghurt formulated with various levels of black rice flour. ^a,bMeans on bars with different letters are significantly different (p<0.05). Con: yoghurt without black rice flour, B2: yoghurt with 2% black rice flour, B4: yoghurt with 4% black rice flour, B6: yoghurt with 6% black rice flour.

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